高等教育自学考试
毕业设计（论文）说明书
农 学 （本科）
市 地 洛 阳
准考证号 030208103550
姓 名 赵 源 涛
河南科技大学高等教育自学考试办公室
高等教育自学考试
毕业设计（论文）任务书
一、题目： 红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨
二、本环节自2009年6月30日起至20010年 6月30日
三、进行地点： 河南科技大学 四、内容要求： 综述简练完整，有见解；立论正确，论述充分，结论严谨合理，实验正确，分析处理科学；文字通顺，技术用语准确，符号统一，编号齐全，书写工整规范，图表完备、整洁、正确；论文结果有应用价值。
指导教师： 职称
批准日期： 年 月 日
红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策探讨
摘 要
红掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum），亦叫安祖花，红鹤芋等，天南星科火烛属。其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名的切花和盆栽花卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。红掌的繁殖方法通常采用分株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很难满足当前市场的需求，组织培养是红掌快速繁殖的有效途径。由于组织培养中经常出现不同程度的污染问题，造成很大的损失，因此控制污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。本文从灭菌方法、内源性污染、继代培养中污染防治等方面，进行了红掌组培快繁过程中污染原因的分析及对策的探讨。
关键词：红掌，组织培养，灭菌，污染，防治
Andraeanum during tissue culture analysis of the causes of pollution and related countermeasures
ABSTRACT
Anthurium, also called Andrew Flower, lines such as flamingo, a Fire Araceae. Its bright colors, tall and straight stem, green leaf-type appearance, are well-known in today's world of cut and potted flowers, one large market potential, with high ornamental value and economic value. Flower andraeanum breeding methods commonly used ramets propagation, cutting propagation and tissue cultur e propagation. However, ramets propagation, cutting propagation is difficult to meet current market demand, tissue culture andraeanum Flower Express are an effective way of breeding. Tissue culture because of the frequent occurrence of various degrees of pollution, resulting in great loss, so control of pollution are industrial plant tissue culture vaccine production technology in the important aspect. This article from the sterilization method, endogenous pollution subculture in such areas as pollution prevention, to discuss how to minimize the emergence of tissue in the pollution problems.
KEY WORDS: Anthurium，tissue culture， sterilization， pollution，prevention and treatment
红掌（拉丁名：Spathiphyllum floribundum），天南星科火烛属，原产地哥伦比亚。其花色艳丽，花茎挺拔，叶型翠绿美观，是当今世界著名的切花和盆栽花卉之一，市场潜力大，具有极高的观赏价值和经济价值。其繁殖方法通常采用分株繁殖、扦插繁殖和组织培养繁殖。但分株繁殖、扦插繁殖很难满足当前市场的需求，组织培养是安祖花快速繁殖的有效途径。
植物组织培养中经常会出现不同程度的污染问题，污染是在组织培养过程中培养基和培养材料滋生杂菌，导致培养失败的现象。它是影响植物组织培养的一个重要因素，它通常会导致培养失败造成很大的损失。植物组培苗的工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养技术日趋完善，但在组织培养中通常会出现不同程度的污染，因此预防和控制污染是植物组织培养苗工厂化生产中重要的技术环节。在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染：一类是通常所说的污染，即外植体消毒不彻底，无菌操作和培养过程中，如：培养基、接种工具、接种室消毒不严格或操作不规范而导致的污染；另一类是内源菌污染，内源菌包括真菌和细菌，内源污染一般是指内源细菌所致的污染。
本文从一般的污染的控制、内源性污染的控制、继代培养中污染防治、减少培养基中的有机成分等方面，讨论了怎样减少组培中出现的污染问题，如：对于一般的污染来说，主要从操作环境、操作人员、仪器；对于内源性污染主要是从外植体预处理到外植体灭菌方法；对于继代培养污染的控制主要是从对无菌外植体进行检验和反复进行茎尖培养或分生组织培养；至于对培养基有机成分的减少措施主要是减去培养基中的VB1、VB6或除去培养基中的蔗糖这几方面加以论述。
培养基是在有菌的环境中配制的，在该过程中会使培养基带有各种杂菌，因此，每次培养基配制完毕和分装后应尽快灭菌，否则培养基中就会滋生各种杂菌，改变培养基的营养成分和pH值，影响培养效果。常用灭菌方法是用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，将培养基置于高压灭菌锅中，从达到要求温度的时刻算起，在0.105Mpa的压力下（121。C）灭菌15-40min。灭菌的时间取决于温度，而不是直接取决于压力。由于容器的体积不同，瓶壁的厚度不同，所需灭菌时间也不同[1]（表1-1），对经过高压灭菌后不会变质的物品，如无菌水、培养皿、器械等，可延长灭菌时间和增加压力。培养基灭菌时间不能过长，否则容易引起培养基中营养成分的损失，并且琼脂也会随灭菌时间的延长，凝固能力下降，甚至不能凝固。因此，所需的灭菌时间应随着要进行灭菌的物体体积而变化。
表1-1 培养基高压蒸汽灭菌所必须的最少时间
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容器的体积（ml） 在121。C下灭菌所必须的最少时间（min）
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20-50 15
75-150 20
250-500 25
1000 30
1500 35
2000 40
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当灭菌锅里的热溶液冷却时，必须十分小心，如果压力下降过急，超过了温度下降的速率，就会使液体滚沸，从培养容器之中溢出。另外，只有当高压锅的压力表指针回到零时，才能打开灭菌锅。
1.2不耐热物质的灭菌
某些生长调节物质（GA3、Zt、IAA、IBA）、尿素以及某些维生素等不耐热的物质遇热易分解，不能进行高压蒸汽灭菌处理，通常只能采用单独液体过滤灭菌方法。热分解化合物溶液的灭菌是通过过滤膜进行过滤灭菌的，然后将其加入经过高压灭菌过的并未凝固的培养基中。
如果是制备固态培养基，方法是先将没有不耐热物质而包含其他化合物的培养基倒入培养瓶中进行高压蒸汽灭菌，灭菌后置于超净工作台上冷却。当其冷却至45。C左右（即琼脂凝固温度），琼脂将要凝固之前，加入经过滤灭菌的各项不耐热成分的溶液，然后混匀放置，待冷凉凝固后备用，但不能在琼脂培养基温度较高时加入，以防止不耐热物质的分解[2]。
2.1外植体的消毒与灭菌
1、用红掌茎尖作外植体时，要尽量选取带菌少的材料，如果室外栽培的材料污染太严重，可先将植物样本挖出，改为室内盆栽，喷布杀虫剂和杀菌剂，不便移栽的，可套塑料袋，待长出新枝条后，再行采样接种。
2、对污染严重的外植体，可以在培养基中加入杀菌剂。也可在菌类长入组织内部时，除去韧皮组织，只接种内部的分生组织可防止材料带菌。
3、外植体消毒常用药剂有：70%～75%的酒精，0.3%～0.6%的次氯酸钠溶液和0.1%的升汞溶液等。选用何种灭菌剂和灭菌时间根据不同情况及操作者的经验来掌握，既要求将外植体表面的微生物彻底杀死，又要求尽可能少伤害外植体组织和表层细胞。先用75%的酒精棉花擦拭外植体材料再使用消毒药剂常能取得较好的消毒效果[3]。常用消毒剂的消毒效果比较见表2-1:
表2-1 常用消毒剂的消毒效果比较
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消毒剂
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使用浓度（%） 去除难易 消毒时间（min） 效果
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次氯酸钙 9～10 易 5～30 很好
次氯酸钠 2 易 5～30 很好
漂白粉 饱和溶液 易 5～30 很好
过氧化氢 10～12 最易 5～15 好
升汞 0.1～1 较难 20～30 好
酒精 70～75 易 几秒至几分钟 好
抗菌素 4～5(mg/L) 中 30～60 较好
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3.1器皿、工具的灭菌
3.1.1器皿与金属器械的灭菌
1、玻璃器皿的灭菌
可采用湿热灭菌法，即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌器中进行高温高压灭菌，灭菌时间可长到25～30min。也可采用干热灭菌法，即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌；还可以把玻璃器皿放入水中煮沸灭菌[4]。
2、金属器械的灭菌
一般用火焰灭菌法，即把金属器械放在95%的酒精中浸一下，然后放在火焰上灼烧灭菌。这一步在无菌操作中有要反复进行。
3.1.2布质制品的灭菌
3.2培养室的灭菌
每次接种前应对接种室的地面进行清洁卫生工作，并用75%的酒精喷雾使空气中的灰尘沉降，并用紫外灯照射20～30min。接种前工作台面要用新洁尔灭或75%酒精擦洗,使用超净工作台对接种环境污染的控制更有成效。但它应置放在洁净的房间，窗户密封，并定期清洗过滤膜，以延长使用寿命。培养室的相对湿度应控制在70%左右，相对湿度太高可以用抽湿机除湿。接种结束后，应进行地面清洁卫生工作，即先打扫一遍，再用湿布擦过，并定期用甲醛熏蒸接种室。
3.3无菌操作和无菌操作技术
植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程，如少有疏忽，都会造成无法挽回的后果，使工作前功尽弃。污染中特别注意一种呈乳白色的细菌污染，这种细菌为芽孢杆菌。法国林木育种协会鉴定为迟缓芽孢杆菌，它外被荚膜，耐高温，一般消毒剂难以杀死。它可随培养材料、用具等传播；也可出现在培养基表面，或呈滴形云雾状存在培养基内，若出现时应严格灭菌，清洗和消毒用具，并更换消毒酒精[6]。
操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。因为有很多组织培养的失败，从材料、培养基条件等方面检查均无问题，只是由于操作技术不熟练，如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌，再同时接种的环境又不是绝对无菌的。所以工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点：
1、入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。
2、入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。
3、操作前要用70% 的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。
4、必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。
初代培养获得的无菌材料在后期或继代培养也可能出现污染，这一方面是由于操作不慎的原因，另外即是由于初代培养中使用了营养相对简单的培养基有可能使污染不易表现出来，有时继代材料在培养室则可能被螨传播的真菌污染。
对已污染的红掌组培苗，有时因植物材料难得或重新发生要花费很多时间，也可切取较大的植株重新消毒接种。李春燕等用400或600万单位/L的青霉素无菌水溶液分别浸泡红掌组培细菌污染苗60min或40min，可有效防治组培中的细菌污染。经处理过的苗继代培养时，不再重复出现细菌污染现象，且苗分化能力强，生根培养时，根系发达，移栽成活率高[7]。李颖等的实验研究证明，如果继代培养中只有真菌污染，采用3%的多菌灵无菌液浸泡0.5h以上即可，用无菌水冲洗后接种或不用无菌水冲洗直接接种都可消除真菌污染。如果在细菌污染和细菌、真菌同时污染的情况下，可采用 HgCl2消毒法，把污染的红掌培养苗切割成较长的茎段作外植体，用自来水冲洗0.5h，再在超净工作台上用乙醇和HgCl2进行短时间的处理即可再度建立无菌苗培养体系[8]。
5.1通常污染
在培养过程中，培养材料附近经常出现黏液或混浊的水迹，并有发酵状泡沫。这大多是细菌性污染，主要是由于使用了未消毒好的工具及操作者呼吸时排出的细菌所引起的，或是操作人员的手接触了材料或器皿边缘所致；有时培养基上还会出现黄、白、黑等不同颜色的霉菌，这是真菌性污染，主要是由于接种室空气污染造成的[9]
5.2内源性污染
在红掌组织培养中，由于材料内部的内生菌不能被一般的表面消毒方法所清除，随着材料进入培养过程，引起的污染称为内生性污染或内源性污染。主要有以下几类：黄单胞菌属、芽孢杆菌属、假单胞菌属、土壤杆菌属、棒状杆菌属、欧文氏菌属等。真菌主要有霉菌。
在红掌初代培养中，表面细菌引起的污染通常在2～3天就能在外植体周围或培养基表面形成明显的如水污状、油污状、气泡或干缩的红、黄、乳白等颜色的菌落。而在外植体培养后3～5天内并未发现细菌污染，以后则不段出现明显的或不明显的细菌菌落，就可能是由内生细菌引起的污染[10]。在红掌初代培养或前几代的继代培养中存在的污染，并不形成明显的菌落而只在培养基内部形成“丝状物”，“晕状物”，不易被肉眼发现的，对红掌中的内生细菌，由于它潜伏得较深，表面消毒方法无法将其消灭。有时在外植体的初级培养中，包括前几代的继代培养，往往在培养基上不易被发现，随着继代培养次数的增加，菌量不断的积累，就会在培养基上表现出来。对于这种情况，我们可以利用背光检查法去观察发现它[11]。
5.3污染原因判断及污染苗抢救
1、若污染菌类是零星分散在培养基中，则可确定是人为引起的污染，比如培养基灭菌不彻底；超净工作台长时间不换滤网，致使净化能力降低；接种用具灭菌不彻底；操作不正确，动作生硬缓慢，开瓶时间太久，接种台摆放物品杂乱，操作中心在人体范围之内；接种室长期不灭菌，菌类太多；若污染菌类是从材料周围长起，则可证明是植物材料带菌引起。可能是接种用具灭菌不彻底，接种时材料被污染；或者是未及时发现污染苗，接种过程交叉感染；若是外植体，菌类从材料培养基以上部分长起，而不是从培养基先长起，且发生在5天以后，则说明是材料带的内生菌。若从培养基以下开始长菌，发生时间较早，且有从里向外的趋势，则说明是切口引起的污染，原因有是灭完菌后，未剪去两个切口或虽剪但器具带菌[12]。
2、真菌污染后，如果已形成孢子，则必须经高压灭菌后扔掉，即使仅形成菌丝，菌丝能够达到材料内部，因此，真菌污染是灭绝性的。但若使细菌污染，由于细菌繁殖是靠芽孢，细菌不会弥散整个空间，因此只要及时发现，将材料上部未感菌的部分剪下转接，材料仍可以用。
3、用抗生素等杀菌药剂的处理，虽有不少报道，但至今还未发现那种抗生素能够对各种菌都有效，并且常常也会影响红掌材料的正常生长分化。另一些药剂，虽有的杀菌效果好，但往往容易引起盐害，也无法利用[13]。
5.4预防方法和措施
5.4.1基本方法
1、通风：经常开窗，保持室内空气流通．可以使室内真菌数量减少。通风方法简便易行，应多使用。
2、去湿：保持室内空气干燥，如使用空调“除湿”功能，也可减少真菌生长繁殖。
3、光照：紫外线能杀灭或抑制真菌生长，有调查发现下午一时是大气细菌粒子沉降的一个低谷，说明太阳辐射对空气微生物有明显的杀灭作用。因此，保持室内较好采光，在梅雨季节后将衣物等晾晒，对减少室内真菌污染大有好处[14]。
4、防霉：污染物品和污染培养基不要在培养室近距离开瓶洗刷。
5.4.2经常检查消毒锅的灭菌质量
消毒锅的压力表降到零后不能马上出锅。因冷热空气作用的负压效应，使外界环境的冷空气倒吸入已灭菌好的培养瓶内引起真菌污染，为避免该现象的发生，消毒后培养瓶应留在锅里，等冷却后才出锅。如果出现培养基造成的污染，就要及时地检查灭菌锅的性能或其他的问题。
5.4.3检查培养容器是否存在问题
培养容器封口多用塑料盖、胶塞、棉塞、薄膜等，塑料盖用久了易老化，密封性差，也会造成污染。同时，培养瓶在使用之前要洗净（包括瓶内瓶外），灭好菌的培养瓶不要放在空气中太久，一般出锅后1～2天内接完种最好，以减少培养瓶表面的微生物引起的污染。
5.4.4继代培养中污染的控制
这类污染可以从以下2个方面进行防止。(1)扩大繁殖时应有合理程序。在获得的无菌培养物之后，应将其中一部分作为“原种”保存起来，分批繁殖和复检后再大规模生产。（2）可通过在培养基中加入抗菌剂来防止。多菌灵用于红掌组织培养的抑菌促生长，培养物不受微生物污染，灭菌率为98%以上，无白化苗，生长健壮，不过这种方法不能广泛使用，因为有些植物在抑菌素会受到毒害，如叶片变小、变黄和不能分化等。还有使用时要调到适合的浓度[16]。
5.4.5减少培养基中的有机成分
培养基中有机成分的存在是污染产生的重要原因,去除有机物是减少污染的一条途径。在红掌的组织培养中，除去培养基中的VB1、VB6、烟酸等（保留肌醇）有机成分，经2～3代培养后，能抑制细菌生长，对丛生芽生长增殖没有影响。原因是这些都是某些细菌生长的必须物质，去除这些有机成分后，细菌无法生长发育而慢慢死亡或减少。由日本的古在丰树教授首创的无糖组织快繁技术则全部除去培养基中的有机成分，输入可控制量的CO2气体作为碳源，并通过控制环境因子，促进植株光合作用速率，使之由异养型转变成自养型，因而植物长势良好，污染率明显降低[17]。
污染问题，是红掌组织培养过程中难以杜绝的现象。污染造成的后果是严重的，它会增加接种源及污染的几率，对花卉造成伤害，耗工耗时，提高生产成本。对于如何控制污染，以建立一个洁净、良好的工作与培养环境和无菌的植株系统为组培业所要努力的方向。
目前组培苗污染实验所遇到的问题为不易建立植株的干净度，因此无法确定真正的污染源来自何处，无法对症下药。而且对于菌种的鉴定有很大的困难，因为一般有关植物或是植物病原菌，其背景资料较少，对于鉴定而言，便较棘手。在红掌组织培养中，一般的污染较容易控制，要达到接种的无菌环境条件，无菌操作要求和无菌操作水平。而内源菌则较难控制，要求全部杀死植物表面和组织中的微生物，一般的消毒方法是不能完成的。通过先对外植体植物进行预栽管理、外植体的预处理，并在这基础上，改进消毒方法，（如真空减压法、酸化培养基、灼烧法等），也可除去培养基中的有机成分，这些措施都能降低由内源菌引起的污染。当然，在植物组织培养中，控制污染的方法是可灵活多变的，只要能减少污染，不会发生培养物的遗传变异，实现工厂化快繁，降低成本，能在市场竞争中占有一席之地即可。
本课题在选题及研究过程中得到赵老师的悉心指导。并为我指点迷津，帮助我开拓研究思路，精心点拨、热忱鼓励。
本文从材料的收集到撰都是在赵老师和同学们的关心和鼓舞下顺利进行的。在这期间尽管赵老师很忙但它却仍然抽出时间为我修改论文，使我能够顺利的将本文完成。同学们也不亦乐乎的为我提供帮助，他们积极的为我查资料并相互检查错误共同提高。在我的写作过程中，赵老师多次指导我论文的写作方法和技巧，教我研究的思路和方向。在我写作论文的期间，每当我遇到困难和疑惑时，赵老师总是一针见血的指出我的不足，帮助我拨开迷雾、跨越困难的鸿沟。赵老师始终为人师表，不厌其烦，令我感到无比钦佩。本文是在赵老师的精心指导下完成的，在此我谨向赵老师致以崇高的敬意。
最后，不能忘记我的兄弟姐妹们——我的同学和朋友们，在论文写作的过程中乃至三年的学习生活里，他们与我朝夕相处，互相讨论，共同进步。在此我忠心的向所有帮助过我的老师和同学表示感谢！
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灭菌方法
常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热(烘烧和灼烧)、湿热(常压或高压蒸煮)、射线处理(紫外线、超声波、微波)、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌（培养基）培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。
1、高压灭菌方法是最常用的物理灭菌方法，高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121 ℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到O．05MPa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0．1～0．15Mpa时，维持15～20min。对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20～30min。高压灭菌前后的培养基，其pH值下降0.2～0.3单位。高压后培养基pH值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高pH值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的pH值变化幅度较大，甚至可大于2个pH值单位。环境pH值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖
从而改变培养基的渗透压。在8%～20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0.43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%～25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。
2、灼烧灭菌（用于无菌操作的器械）在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前在酒精灯火焰上灼烧灭菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。
3、干热灭菌（玻璃器皿及耐热用具）干热灭菌是利用烘箱加热到160～180。C的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽孢的抗热水平，通常采用170 ℃持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。
4、过滤灭菌（不耐热的物质）一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。可用无菌的孔径0.20～0.45um的硝酸纤维素膜过滤菌类，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。
5、紫外线和熏蒸灭菌（空间）
(1)紫外线灭菌在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200～300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过120 cm为宜。
(2)熏蒸灭菌用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5～8ml/m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5 g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。
6、喷雾灭菌（物体表面）物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%～2%的来苏儿溶液以及0.25%～1%的新洁尔灭也可以。
CHITOSAN on andraeanum tissue inhibition of bacteria
contamination
Abstract: The fungi was isolated and purified from polluted anthurium subculture medium, identified to be DeuteromycotinaHyphpmycetes Hyphomycetales Dematiaceae and trichoderma. The inhibition effect of the three kinds of chitosan on the fungi wasconducted.The results showed that the chitosan had inhibition effect on the fungi. The higher concentrations of chitosan had a betteinhibition effect than the lower ones.The inhibition effect of 50000 and 250000 molecular weight chitosan is better than that of the3000 molecular weight. It is preliminarily proved that chitosan had good inhibition effect on the fungi from polluted tissue culture , andwill have good application value in the fields of pollution prevention in flowers tissue culture.
Key words: tissue culture; contamination; Chitosan; inhibition effect
Plant tissue culture, not only in plant breeding, rapid propagation of seedlings and the production of useful secondary metabolites, such as the use of a wide range of plant genetic engineering is and Plant Molecular Biology, one of the important foundation for the study [1]. Pollution, browning, glass and tissue culture are the main problems, including pollution of the most common [2]. Therefore take effective prevention and control measures to reduce the chance of contamination occurred, tissue culture is an important guarantee for success. Chitosan (chitosan) is the chitin in strong alkaline conditions from B
After the formation of acyl an important derivative is determined by a number of N-acetyl glucosamine through β-(1-4) glycosidic bond linking the nature of it more lively. Has natural antibacterial properties of chitosan, and a broad spectrum antimicrobial, in recent years, chitosan in various fields such as agriculture，medicine [3], manufacture [4], food [5], etc. The use of great importance. Tissue culture of the chitosan in the application of inhibition has not been reported. This experiment to be from the contaminated medium subculture andraeanum extraction, purification and identification of bacteria contamination, with different molecular weight chitosan and different concentrations of their inhibition, and explore the best inhibitory effect of chitosan molecular weight and the best inhibitory concentration, in order to explore the chitosan as a new type of antimicrobial agent to provide specific information.
After the formation of acyl an important derivative is determined by a number of N-acetyl glucosamine through β-(1-4) glycosidic bond linking the nature of it more lively. Has natural antibacterial properties of chitosan, and a broad spectrum antimicrobial, in recent years, chitosan in various fields such as agriculture，medicine [3], manufacture [4], food [5], etc. The use of great importance. Tissue culture of the chitosan in the application of inhibition has not been reported. This experiment to be from the contaminated medium subculture andraeanum extraction, purification and identification of bacteria contamination, with different molecular weight chitosan and different concentrations of their inhibition, and explore the best inhibitory effect of chitosan molecular weight and the best inhibitory concentration, in order to explore the chitosan as a new type of antimicrobial agent to provide specific information.
1 Materials and Methods
1.1 Test materials
1.1.1 Isolates
Streptomyces bacteria pollution (code-named WCHPA), separated from the laboratory contamination andraeanum subculture medium.
1.1.2 Test for Drugs
Chitosan, a Zhejiang Xing Biotechnology Australia Limited, a molecular weight of 3kd (degree of deacetylation> 80%), 50kd (degree of deacetylation> 90%), 25kd (degree of deacetylation> 90%)[6].
1.1.3 Medium PDA medium
Potatoes 200g, glucose 20g, agar 20g, distilled water 1000ml, pH value of the natural.
1.2 Test Method
1.2.1 Isolation and purification
Clean out the work in Taichung andraeanum subculture medium pollution fungi, from PDA medium. Repeat several times until the colony characteristics and morphology changes are no longer, we can identify bacteria have been purified.
1.2.2 Identification of bacteria contamination
Continuous observation of colony morphology after purification. Film production equipment to further observe the shape strain, mycelium, spores, spore cell spore cell morphology and conidiation of the ways and forms and so on, taking pictures with a digital microscope.
1.2.3 Bacteriostatic Test
That the different molecular weight chitosan with 1M solution of acetic acid dissolved mixed with PDA medium to produce a final concentration of chitosan (0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0)mg/ml of culture medium, 1M solution of sodium hydroxide by adjusting pH value of 6.0, in addition to the control without chitosan, the other with the addition of chitosan in the same medium[7]. To eliminate all high-pressure cooker sterilization 30min under 121 ℃ and pour plate. Mycelium white to green after 24h and then into a brown, hyphae developed, velvet-like, 3d training around the middle of the brown and white flocculent mycelium of fimbriae produced. Hyphae are separated from a long stalk conidia to produce lateral branches whorled branches meristematic conidiation short bottles. Single-cell conidia oval, smooth.
2 Results and Analysis
2.1 Andraeanum symptoms subculture medium pollution
Andraeanum subculture in growth medium brown Fimbriae, medium surface was black, brown and white mycelium on the flocculation between the hyphae.
2.2 fungal pure culture and identification of the results
PDA medium in the upper colony diameter, edge neatly, spore germination of the PDA medium by adding chitosan, 4d clearly observed after the colony is surrounded by a black halo, black halo and colony growth as to the relocation of . The better the general inhibitory effect of the more obvious black halo[8]. Colony has no control this phenomenon. Chitosan molecular weight and concentration of the bacteriostatic effect.
2.3. The same three concentrations of the bacteriostatic effect of chitosan molecular weight compared
Concentration of 0.5mg/ml 3 species of molecular weight chitosan WCHPA colony inhibitory effect of six concentrations of three kinds of molecular weight of chitosan on the inhibition rate of colony WCHPA results 0.5mg/ml concentration of three kinds of molecular weight chitosan there is no clear law, the maximum inhibitory rate of 50,000 in molecular weight of chitosan for the culture medium for 20.45%. Inhibitory rate and the time and no close ties. The results show that the concentration of 0.5mg/ml of the three kinds of molecular weight of the antibacterial effect of chitosan has not been satisfactory[9]. 5d prior to the first three kinds of chitosan molecular weight the greater the inhibitory rate of the higher molecular weight, and are extended over time to reduce the rate of inhibition. In paragraph 5d, 3000 molecular weight inhibitory rate of more than two other inhibitory rate of molecular weight, molecular weight and inhibition rate of 3000 also reached the highest value. At its bacteriostatic effect after 7d and 5d is similar to before, the greater the inhibitory rate of the higher molecular weight.
3 Discussion and conclusions
3.1 Chitosan as a potential new antibacterial agents
Pollution plant tissue can be broadly divided into two types of operations may produce air pollution mainly mold contamination; explants is itself brought about by bacteria primarily by fungal and bacterial contamination[10]. High inhibitory rate was as high as 79.55%. Antibiotics in tissue culture is now the most common molecular weight of chitosan and 3.2 have an important impact on antimicrobial properties of the experimental results from the 50,000 and 250,000 the bacteriostatic effect of chitosan molecular weight than that of 3000; the highest inhibitory rate in the 250,000 molecular weight concentration of 3.0mg/ml and 2.0mg/ml of the two. But on the whole, taking into account the factors of price and its operation to the conclusion that the experimental molecular weight of 50,000 as the best concentration of 1.5mg/ml.
3.2 Concentration on the antimicrobial properties of chitosan have a significant impact
1.1 Test materials
1.1.1 Isolates
Streptomyces bacteria pollution (code-named WCHPA), separated from the laboratory contamination andraeanum subculture medium.
1.1.2 Test for Drugs
Chitosan, a Zhejiang Xing Biotechnology Australia Limited, a molecular weight of 3kd (degree of deacetylation> 80%), 50kd (degree of deacetylation> 90%), 25kd (degree of deacetylation> 90%)[6].
1.1.3 Medium PDA medium
Potatoes 200g, glucose 20g, agar 20g, distilled water 1000ml, pH value of the natural.
1.2 Test Method
1.2.1 Isolation and purification
Clean out the work in Taichung andraeanum subculture medium pollution fungi, from PDA medium. Repeat several times until the colony characteristics and morphology changes are no longer, we can identify bacteria have been purified.
1.2.2 Identification of bacteria contamination
Continuous observation of colony morphology after purification. Film production equipment to further observe the shape strain, mycelium, spores, spore cell spore cell morphology and conidiation of the ways and forms and so on, taking pictures with a digital microscope.
1.2.3 Bacteriostatic Test
That the different molecular weight chitosan with 1M solution of acetic acid dissolved mixed with PDA medium to produce a final concentration of chitosan (0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0)mg/ml of culture medium, 1M solution of sodium hydroxide by adjusting pH value of 6.0, in addition to the control without chitosan, the other with the addition of chitosan in the same medium[7]. To eliminate all high-pressure cooker sterilization 30min under 121 ℃ and pour plate. Mycelium white to green after 24h and then into a brown, hyphae developed, velvet-like, 3d training around the middle of the brown and white flocculent mycelium of fimbriae produced. Hyphae are separated from a long stalk conidia to produce lateral branches whorled branches meristematic conidiation short bottles. Single-cell conidia oval, smooth.
2 Results and Analysis
2.1 Andraeanum symptoms subculture medium pollution
Andraeanum subculture in growth medium brown Fimbriae, medium surface was black, brown and white mycelium on the flocculation between the hyphae.
2.2 fungal pure culture and identification of the results
PDA medium in the upper colony diameter, edge neatly, spore germination of the PDA medium by adding chitosan, 4d clearly observed after the colony is surrounded by a black halo, black halo and colony growth as to the relocation of . The better the general inhibitory effect of the more obvious black halo[8]. Colony has no control this phenomenon. Chitosan molecular weight and concentration of the bacteriostatic effect.
2.3. The same three concentrations of the bacteriostatic effect of chitosan molecular weight compared
Concentration of 0.5mg/ml 3 species of molecular weight chitosan WCHPA colony inhibitory effect of six concentrations of three kinds of molecular weight of chitosan on the inhibition rate of colony WCHPA results 0.5mg/ml concentration of three kinds of molecular weight chitosan there is no clear law, the maximum inhibitory rate of 50,000 in molecular weight of chitosan for the culture medium for 20.45%. Inhibitory rate and the time and no close ties. The results show that the concentration of 0.5mg/ml of the three kinds of molecular weight of the antibacterial effect of chitosan has not been satisfactory[9]. 5d prior to the first three kinds of chitosan molecular weight the greater the inhibitory rate of the higher molecular weight, and are extended over time to reduce the rate of inhibition. In paragraph 5d, 3000 molecular weight inhibitory rate of more than two other inhibitory rate of molecular weight, molecular weight and inhibition rate of 3000 also reached the highest value. At its bacteriostatic effect after 7d and 5d is similar to before, the greater the inhibitory rate of the higher molecular weight.
3 Discussion and conclusions
3.1 Chitosan as a potential new antibacterial agents
Pollution plant tissue can be broadly divided into two types of operations may produce air pollution mainly mold contamination; explants is itself brought about by bacteria primarily by fungal and bacterial contamination[10]. High inhibitory rate was as high as 79.55%. Antibiotics in tissue culture is now the most common molecular weight of chitosan and 3.2 have an important impact on antimicrobial properties of the experimental results from the 50,000 and 250,000 the bacteriostatic effect of chitosan molecular weight than that of 3000; the highest inhibitory rate in the 250,000 molecular weight concentration of 3.0mg/ml and 2.0mg/ml of the two. But on the whole, taking into account the factors of price and its operation to the conclusion that the experimental molecular weight of 50,000 as the best concentration of 1.5mg/ml.
3.2 Concentration on the antimicrobial properties of chitosan have a significant impact
Qiu-ping [11], The results show that the antimicrobial effect of chitosan with its concentration increases, the experimental results support the results of the study. A wide range of applications of chitin, chitosan in the medical, food, environmental protection, in areas such as chemical products have wide-ranging and important applications. Chitosan flowers will be used for tissue culture would be very good prospects.
References
[1]MK.Razdan. Zun-Xiao-an, ZHU Yang translation. Introduction to Plant Tissue Culture [M]. Beijing: Chemical Industry Press ,2006:1-2.
[2]Hu, ZHANG Li-jun,baixuemei, et al. Plant Tissue Culture Pollution Analysis and the disinfection of explants [J]. Anhui Agricultural Science, 2007,35 (3) :680-681.
[3]Yi-Ting Wang,wanglianping , Mou Hero, et al. Industrial production of tissue culture studies of pollution and its control [J]. Anhui Agricultural Science, 2005, 33 (12): 2357 - 2358.
[4]Chiang big. Chitin [M]. Beijing: China Environmental Science Press, 1996.
[5]Fu Tian Xia, LIU Xiao-yu, Liu Zhiheng. Chitosan's antibacterial properties of the progress of applied research [J]. Liaoning Chemical, 2005,1234 (12) :541-544.
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[9]wuxiaoyong, Qing-Xiao Zeng, MOshaofang. Several of the antibacterial properties of chitosan [J]. Food and Fermentation Industry, 2005,206 (2) :18-21.
[10]Hu, ZHANG Li-jun,baixuemei, et al. Plant Tissue Culture Pollution Analysis and the disinfection of explants [J]. Anhui Agricultural Science, 2007,35 (3) :680-681.
[11]Qiu-ping, Chitosan on mango Colletotrichum gloeosporioides, Diplodia antagonism bacteria [J]. Food and machinery, 2005,21, (1) :25-27.
壳聚糖对红掌组培污染菌的抑制作用
摘要：在污染的红掌继代培养基中提取污染菌并进行了分离及纯化，初步鉴定为为半知菌亚门（Deuteromycotina),丝孢纲（Hyphpmycetes),丝孢目（Hyphomycetales）,淡色孢科（Dematiaceae）,木霉属（trichoderma）。研究了壳聚糖对该菌的抑制作用，探索了3种分子量及其6种浓度的壳聚糖对该菌的抑制效果。结果表明：壳聚糖对该污染菌有抑制作用，5 万和 25 万分子量的抑菌效果高于 3000 分子量，浓度越高，抑菌效果越好。初步证实了壳聚糖对组培污染菌类有很好的抑制作用，在花卉组织培养污染防治方面具有应用价值。
关键词：组织培养；污染；壳聚糖；抑制作用
植物组织培养不仅在植物育种、 苗木快速繁殖和有用次生代谢产物生产等方面应用广泛，也是植物基因工程和植物分子生物学研究的重要基础之一[1]。污染、褐化、玻璃化等是组织培养存在的主要问题，其中污染最普遍 [2]。因此采取有效的防控措施，降低污染发生的机率，是组织培养成功的重要保障。壳聚糖（chitosan）是甲壳素在强碱性条件下进行脱乙酰基作用后形成的一种重要的衍生物， 是由多个N-乙酰氨基葡萄糖通过β-(1-4)糖苷键连接起来，但它的性质较为活泼。壳聚糖具有天然抑菌性能，且抑菌谱广，近年来壳聚糖在各个领域如农业、医学[3]、制造[4]、食品[5]等方面中的运用受到很大的重视。有关壳聚糖在组织培养中的抑菌应用尚未见报道。本实验拟从污染的红掌继代培养基中提取、纯化污染菌并进行鉴定，用不同分子量及其不同浓度的壳聚糖对其进行抑制实验， 摸索出抑菌效果最好的壳聚糖分子量及最佳抑菌浓度，为探索壳聚糖成为新型的抑菌剂提供具体信息。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 供试菌株
霉菌污染菌（代号 WCHPA），分离于实验室污染的红掌继代培养基中。
1.1.2 供试药品
壳聚糖，有浙江澳兴生物科技有限公司提供，分子量为3kd（脱乙酰度〉80%） ，50kd（脱乙酰度〉90%），25kd（脱乙酰度〉90%）[6]。
1.1.3 培养基 PDA培养基
土豆200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH值自然。
1.2 试验方法
1.2.1 污染菌的分离及纯化
在超净工作台中挑出红掌继代培养基中的污染真菌，接到PDA培养基中。重复若干次，直至菌落特征及其显微形态不再有变化，可确定菌种已纯化。
1.2.2 污染菌的鉴定
连续观察纯化后的菌落形态。制作装片，进一步形观察菌株、菌丝、孢子、产孢细胞的形态及产孢细胞的产孢方式和形态等，用数码显微镜进行拍照。
1.2.3 抑菌试验
称取不同分子量壳聚糖用 1M 的乙酸溶液溶解后与PDA培养基混合，制成壳聚糖终浓度分别为（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0）mg/ml 的培养基，用 1M 的氢氧化钠溶液调节 pH 值为 6.0，对照除不加壳聚糖外，其他与加有壳聚糖的培养基相同[7]。高压灭均锅121℃下灭菌30min后倒平皿。产生白色菌丝24h后变为绿色继而变为褐色，菌丝发达，绒状，培养3d左右，在褐色菌丝中间有白色絮状的菌毛产生。菌丝有隔，分生孢子梗长，产生侧向分枝，分生枝上轮生短的产孢瓶体。分生孢子单胞卵圆形、光滑。
2 结果与分析
2.1 红掌继代培养基污染症状
在红掌继代培养基中长出褐色的菌毛，培养基表面呈黑色，褐色的菌丝上间有白色絮状的菌丝。
2.2 真菌纯培养的形态特征及鉴定结果
菌落在 PDA 培养基上等径生长，边缘整齐，孢子萌发加入壳聚糖的PDA培养基，4d后能明显观察到菌落周围有黑色晕圈，且黑色晕圈随着菌落的生长而向外移。一般抑菌效果越好黑色晕圈越明显[8]。对照菌落始终没有出现这种现象。壳聚糖的分子量和浓度影响抑菌效果。
2.3相同浓度的三种分子量壳聚糖抑菌效果的比较
浓度为0.5mg/ml 3种分子量壳聚糖对WCHPA菌落的抑制效果 6个浓度3种分子量壳聚糖对WCHPA菌落的抑菌率结果0.5mg/ml 浓度的 3 种分子量壳聚糖之间没有明显的规律， 最高抑菌率出现在分子量为5万的壳聚糖培养基中为20.45%。抑菌率和时间上也没有紧密的联系。结果表明在0.5mg/ml 浓度下3种分子量的壳聚糖的抑菌效果都不理想[9]。第5d之前3种分子量壳聚糖分子量越大抑菌率越高，而且都是随着时间的延长抑菌率降低。在第5d，3000 分子量的抑菌率超过其它两种分子量的抑菌率，而3000分子量的抑菌率也达到最高值。在第7d后抑菌效果和第5d之前的相似，分子量越大抑菌率越高。
3 讨论与结论
3.1 壳聚糖成为新型抑菌剂的可能
植物组培的污染大致可分为两种，一种是操作中产生得污染，主要是霉菌的污染；一种是外植体自身所带杂菌主要是由真菌和细菌的污染[10]。高抑菌率高达79.55%。抗生素是现在组培中最常见，分子量对壳聚糖抗菌性能有重要影响，从实验结果来看5万和 25 万壳聚糖的抑菌效果要好于3000 分子量的；最高抑菌率出现在 25 万分子量 3.0mg/ml和 2.0mg/ml 两个浓度中。但总体考虑到价格及其操作因素上本实验的结论是5万分子量1.5mg/ml浓度为最佳。
3.2 浓度对壳聚糖抗菌性能有重要影响
钟秋平[11]的研究结果均表明壳聚糖的抑菌作用随其浓度的增加而增大，本实验结果支持上述研究结果。甲壳素应用范围广泛，壳聚糖在医学、食品、环保、日化用品等领域都有着广泛而重要的应用。将壳聚糖用于花卉组织培养将有很好的前景。
参考文献
[1]M.K..Razdan.肖尊安,祝扬译.植物组织培养导论[M].北京:化学工业出版社,2006:1-2.
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[6]于汉寿,吴汉章,杨冰.壳聚糖抑制植物病害的研究进展[J].天然产物研究与开发,1999,12(3):94-97.
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[8]吴俊,夏文水.非生物因素对壳聚糖抗菌活性的影响[J].食品学,2004,25(7):53-55.
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[10]胡凯,张立军,白雪梅,等.植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J].安徽农业科学, 2007,35(3):680-681.
[11]钟秋平,壳聚糖对芒果炭疽病菌、蒂腐病菌的拮抗作用[J].食品与机械,2005,21,(1):25-27.